การทดลองวันศุกร์ที่ 9 ก.ย. 54

การเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ และเทคนิคปลอดเชื้อ

วัสดุอุปกรณ์

1.       บีกเกอร์ขนาด  600  ml           7.  หม้อนึ่งความดันไอ

2.       น้ำกลั่น  500  ml                  8.  Hot plate

3.       Dextose  10 g                     9.  ตะเกียงแอลกอฮอล์

4.       ผงวุ้น  7.5  g ***                   10.  แอลกอฮอล์  70% ***

5.       Dettol (น้ำนาฆ่าเชื้อ) ***          11.  จานเพาะเชื้อ

6.       ผ้าสะอาดเช็ดโต๊ะ ***

#หมายเหตุ : แต่ละกลุ่มเตรียมอุปกรณ์มาเฉพาะที่ *** ไว้

วิธีการเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ

1.       เตรียมน้ำต้มมันฝรั่ง (มันฝรั่ง 100 g ต่อน้ำกลั่น 500 ml) 500 ml

2.       เตรียมน้ำกลั่น 500 ml แล้วนำไปต้มให้อุ่นๆ จากนั้นเติม Dextose 10 g คนให้ละลายเป็นเนื้อเดียวกัน

3.       เติมผงวุ้น 7.5 g ลงในสารละลายในข้อ 2 คนให้เข้ากัน จากนั้นนำสารละลายในข้อ 1 มาผสมและคนให้เข้ากัน

4.       นำสารละลายในข้อ 3 หรื PDA ไปฆ่าเชื้อด้วยหม้อนึ่งความดันไอ ที่ระดับอุณหภูมิ 121 C ระดับความดัน 15 ปอนด์/ตารางนิ้ว เป็นเวลา 30 นาที

# หมายเหตุ : ในการทดลองในครั้งนี้ไม่ได้ทำการทดลองในข้อ 1 และ 4 แต่จะสาธิตให้ดูในเบื้องต้น

การเตรียมอุปกรณ์และพื้นที่ปลอดเชื้อ

1.       นำอุปกรณ์เครื่องแก้วทุกชนิดที่จะใช้ในการปฏิบัติการทางจุลชีววิทยา อันได้แก่ แท่งแก้ว บีกเกอร์ และจานเพาะเชื้อ หรือ หลอดทดลอง มาล้างทำความสะอาด

2.       นำอุปกรณ์จากข้อ 1 มาฆ่าเชื้อด้วยหม้อนึ่งความดันไอที่ระดับอุณหภูมิ 121 C ระดับความดัน 15 ปอนด์/ตารางนิ้ว เป็นเวลา 30 นาที

** ขั้นตอนในข้อ 1 – 2 เตรียมการก่อนการทดลอง

3.       เช็ดโต๊ะปฏิบัติการที่จะทำการเทอาหารเลี้ยงเชื้อด้วยสารละลาย Dettol (ความเข้มข้น 1:1)

4.       จุดตะเกียงแอลกอฮอล์ในบริเวณที่จะปฏิบัติการ และในขณะปฏิบัติการต้องมีไฟติดอยู่ตลอดเวลา และทำการทดลองใกล้ๆ พื้นที่ของตะเกียงแอลกอฮอล์

การเทอาหารเลี้ยงเชื้อ

1.       นำจานเพาะเชื้อและอาหารเลี้ยงเชื้อมาวางในพื้นที่ปลอดเชื้อที่เตรียมไว้

2.       เปิดจานเพาะเชื้อให้กว้างพอประมาณใกล้ๆ ตะเกียงแอลกอฮอล์

3.       เทอาหารเลี้ยงเชื้อที่ผ่านการฆ่าเชื้อลงในจานเพาะเชื้อ ขณะที่อาหารยังอุ่นๆอยู่ให้มีปริมาตรประมาณ 1/3 ของจานเพาะเชื้อ และรีบปิดฝาอย่างรวดเร็ว

แนวทางการปฏิบัติการในการปฏิบัติงานทางจุลชีววิทยา

1.       ต้องไม่นำวัสดุอุปกรณ์ที่ไม่เกี่ยวข้องกับการปฏิบัติการมาวางบนโต๊ะปฏิบัติการ

2.       ต้องทำความสะอาดโต๊ะปฏิบัติการ และเช็ดด้วยน้ำยาฆ่าเชื้อ (Dettol) ทั้งก่อนและหลังปฏิบัติการ

3.       ต้องล้างมือให้สะอาดด้วยสบู่ และเช็ดมือด้วยน้ำยาฆ่าเชื้อ (Alcohol 70%) ก่อนและหลังปฏิบัติการทุกครั้ง

4.       ควรปฏิบัติการในที่ที่ไม่มีลมพัด ป้องกันเชื้อ

5.       การทิ้งเศษอาหารที่เป็นวุ้น ควรใส่ในถุงพลาสติก แล้วนำไปทิ้งถังขยะ

6.       อุปกรณ์ที่ใช้ในปฏิบัติการทางจุลชีววิทยาต้องผ่านการฆ่าเชื้อทั้งก่อนและหลังการใช้งานเสมอ

ภาระงาน

1.       ถ่ายภาพการปฏิบัติการด้วยกล้องถ่ายรูปทุกขั้นตอน

2.       บันทึกผลการทดลองเป็นภาพถ่ายขั้นตอนการปฏิบัติการต่างๆ

3.       เขียนปฏิบัติการเพิ่มเติมเกี่ยวกับการใช้งานหม้อนึ่งความดันไอ

4.       สรุปผลและอภิปรายผลให้เขียน Flow chart ขั้นตอนการเตรียมอาหาร, การเตรียมพื้นที่ปลอดเชื้อ และ การเทอาหารเลี้ยงเชื้อ

(Report นี้ 20 คะแนน)

การทดลองวันศุกร์ที่ 2 ก.ย. 54

การสกัดดีเอ็นเอจากกล้วยอย่างง่าย

วัสดุอุปกรณ์

1.             เครื่องปั่น      (1 เครื่อง/ห้อง)                        9.  หลอดทดลองขนาดใหญ่            

2.             บีกเกอร์                                                            10.  หลอดหยด                                   

3.             เกลือป่น                                                           11.  น้ำยาล้างจาน

4.             แอลกอฮอล์ 95%                                           12.  น้ำกลั่น

5.             กล้วย  (1 หวี/ห้อง)                                        13.  ผ้าขาวบาง

6.             แท่งแก้ว                                                          14.  น้ำแข็ง

7.             กระบอกตวงขนาดใหญ่                              15.  ช้อนชาหรือช้อนชงกาแฟ

8.             กรวย

วีธีการทดลอง

1.             นำแอลกอฮอล์ 90% ประมาณ 30 ml ใส่ลงในบีกเกอร์และนำไปแช่น้ำแข็งไว้

2.             นำกล้วยขนาดพอประมาณปั่นกับน้ำกลั่น 250 ml ด้วยเครื่องปั่น

3.             ผสมน้ำยาล้างจาน 1 ช้อนชา และเกลือป่น 1 ช้อนชา ลงในบีกเกอร์ คนให้เข้ากัน ระวังอย่าให้เกิดฟอง

4.             ตักกล้วยบด 3 ช้อนชาใส่ลงในบีกเกอร์ข้อ 3 แล้วคนประมาณ 5 -10 นาที จากนั้นกรองเอาแต่น้ำใส่ในหลอดทดลองขนาดใหญ่ด้วยผ้าขาวบาง

5.             หยดแอลกอฮอล์ 95% แช่เย็นลงในหลอดทดลอง 2 – 3 หยด ตั้งทิ้งไว้ 2 – 3 นาที แล้วสังเกตผลที่ได้

แนวข้อสอบเก็บคะแนนการออกแบบการทดลอง

***สอบเก็บคะแนนแบบเขียนตอบ โดยเขียนเฉพาะจุดประสงค์การทดลองอย่างน้อย 2 ข้อ และออกแบบวิธีการทดลอง เขียนเป็นข้อๆ เรียงตามลำดับขั้นตอนให้ถูกต้อง***

ข้อสอบ
1.  แสงมีผลต่อการสร้างอาหารของพืชหรือไม่
2.  ปริมาณคลอโรฟิลล์มีผลต่อการสร้างอาหารของพืชหรือไม่
3.  แรงโน้มถ่วงของโลกมีผลต่อทิศทางการงอกของรากหรือไม่
4.  สัตว์หายใจออกเป็นแก๊สคาร์บอนไดออกไซด์ใช่หรือไม่
5.  ทดสอบสาร A ว่าเป็นสารอาหารประเภทใด (คาร์โบไฮเดรต, โปรตีน, ไขมัน)
6.  แก๊สที่เกิดจากกระบวนการสังเคราะห์แสงของพืชคือแก๊สออกซิเจนใช่หรือไม่
7.  คาร์บอนไดออกไซด์มีผลต่อกระบวนการสังเคราะห์ด้วยแสงของพืชหรือไม่
8.  ผลไม้ที่เก็บมาจากต้นแล้วยังมีการหายใจอยู่ใช่หรือไม่
9.  การแยกเกลือออกจากทราย
10.  การศึกษาการเปลี่ยนแปลงรูปร่างของเซลล์เนื่องจากความแตกต่างของความเข้มข้นของสารละลาย
11.  การแยกสารผสมระหว่างผงเหล็ก ผงถ่าน และเกลือ
12.  ตรวจสอบเพื่อเปรียบเทียบปริมาณวิตามินซีในน้ำผลไม้
13.  การตรวจสอบสาร B ว่าเป็นแขวนลอย คอลลอย์ หรือสารละลาย
14.  แอลกอฮอล์คือสารที่เกิดจากกระบวนการหมักของยีสต์ใช่หรือไม่
15.  การแยกองค์ประกอบของหมึกดำ

***ใช้แนวความคิดแบบกระบวนการทางวิทยาศาสตร์นะคะ***

ปฏิบัติการวันที่ 1 ก.ค. 2554

การแบ่งเซลล์แบบไมโทซิส (mitosis)

การแบ่งเซลล์แบบนี้ทำให้เกิดการเพิ่มจำนวนเซลล์ในร่างกาย (somatic cell) ทำให้สัตว์และพืชมีการเจริญเติบโต และเป็นการแบ่งเซลล์เพื่อการสืบพันธุ์แบบไม่อาศัยเพศในสิ่งมีชีวิตเซลล์เดียวและหลายเซลล์เซลล์ก่อนการแบ่งเซลล์เรียก เซลล์แม่ (mother cell) มีโครโมโซม (chromosome) เป็นดิพลอยด์ (diploid) หรือ 2n (n = ชนิดของโครโมโซม) 2n หมายความว่า มีโครโมโซมชนิดที่เหมือนกัน 2 แท่ง เช่นคนมีโครโมโซม 46 แท่ง มี 23 คู่      เมื่อเซลล์แม่แบ่งเซลล์แบบไมโทซิสแล้วได้เซลล์ลูก 2 เซลล์ (daughter cell) แต่ละเซลล์มีโครโมโซม เป็น 2n   เท่ากับเซลล์แม่

วัฏจักรของเซลล์ประกอบด้วยขั้นตอน 2 ขั้นตอน คือ

       1) ระยะอินเตอร์เฟส (interphase)  เป็นระยะที่เซลล์เตรียมตัวให้   พร้อมก่อนที่จะแบ่งนิวเคลียสและไซโทพลาซึม เซลล์ในระยะนี้ มีนิวเคลียสขนาดใหญ่ และเห็นนิวคลีโอลัสชัดเจนเมื่อย้อมสี แบ่งเป็นระยะย่อยได้ 3 ระยะ คือ

     - ระยะก่อนสร้าง DNA หรือระยะ จี1

     - ระยะสร้าง DNA หรือระยะเอส

     - ระยะหลังสร้าง DNA หรือระยะ จี2

       2) ระยะที่มีการแบ่งเซลล์แบบไมโทซิส (mitotic phase หรือ M phase)  เป็นระยะที่มีการแบ่งนิวเคลียส เกิดขึ้นในช่วงสั้นๆ แล้วตามด้วยการแบ่งของไซโทพลาซึม การแบ่งนิวเคลียสแบบไมโทซิส อาจแบ่งได้เป็น 4 ระยะคือ

     - ระยะโพรเฟส (prophase) เป็นระยะที่นิวเคลียสยังมีเยื่อหุ้มอยู่

     - ระยะเมทาเฟส (metaphase) เป็นระยะที่เยื่อหุ้มนิวเคลียสสลายตัว

     - ระยะแอนาเฟส (anaphase) เป็นระยะที่โครโมโซมแยกกันเป็น 2 กลุ่ม

     - ระยะเทโลเฟส (telophase) เกิดการแบ่งของไซโทพลาซึมขึ้น

วัสดุอุปกรณ์

1.     ขวดปากกว้าง บีกเกอร์ หรือแก้วน้ำ

2.    ใบมีดโกน

3.    ชุดตะเกียงแอลกอฮอล์

4.    กล้องจุลทรรศน์

5.    สไลด์ และกระจกปิดสไลด์

6.    หลอดหยด

7.    ดินสอชนิดที่มียางลบติดอยู่

8.    กรดไฮโดรคลอริก เข้ข้น 1 mol/l

9.    น้ำกลั่น

10. สีอะซีโทคาร์มีน เข้มข้น 0.5%

11. หัวหอมแดง หรือหัวหอมใหญ่

การเตรียมตัวอย่างปลายรากหอม

        นำหัวหอมหรือหอมแดงมาเฉือนบริเวณที่เกิดรากติดกับลำต้น วางบนตะแกรงที่อยู่เหนือกะละมังหรือแก้วน้ำซึ่งมีน้ำอยู่ให้หัวหอมส่วนที่เฉือนแช่น้ำเพียงเล็กน้อย ทิ้งไว้ในที่มืดประมาณ 3-4 วัน จะเกิดรากใหม่

การย้อมสี

1.    ตัดปลายรากหอมยาวประมาณ 0.5 ซม. นำมาวางบนสไลด์ แล้วหยดกรดไฮโดรคลอริกให้ท่วม ผ่านสไลด์ไปบนเปลวไฟ 3-4 ครั้ง ระวังอย่าให้กรดแห้ง แล้วล้างกรดออกโดยหยดน้ำกลั่นลงบนสไลด์และเทออก 2-3 ครั้ง

2.    ซับน้ำให้แห้งแล้วหยดสีอะซีโทคาร์มีน ผ่านเปลวไฟ ระวังอย่าให้สีเดือดและแห้ง แล้วปิดด้วยกระจกปิดสไลด์

3.    ใช้ดินสอด้านที่มียางลบติดอยู่เคาะเบาๆบนกระจกปิดสไลด์ เพื่อให้เซลล์กระจาย แล้วซับบริเวณข้างๆกระจกปิดสไลด์ให้แห้ง

4.    ตรวจดูเซลล์รากหอมที่อยู่บนสไลด์ด้วยกล้องจุลทรรศน์ สังเกตความแตกต่างของแต่ละเซลล์ แล้วถ่ายภาพเซลล์ระยะต่างๆของการแบ่งเซลล์ไว้

 ภาระงาน

1.  ถ่ายรูประยะต่างๆของการแบ่งเซลล์

แจ้งการสอบเรื่องการใช้เครื่องแก้ว

วันที่ 24 มิ.ย. 2554 สอบเรื่องการใช้อุปกรณ์เครื่องแก้วทั้งนักเรียนหญิงและชาย ใช้เวลาประมาณ 3 ชัวโมง กรุณาเตรียมอาหารกลางวันมาบริโภคให้เรียบร้อย

การเตรียมสไลด์สด (Wet mount)

วิธีการเตรียมสไลด์สด

            1. หยดน้ำ 1 -2 หยดด้วยหลอดหยดลงบนแผ่นสไลด์

            2. เด็ดใบสาหร่ายหางกระรอกใบยอดสุดวางบนหยดน้ำบนสไลด์

            3. ปิดด้วยกระจกปิดสไลด์ โดยวางทำมุม 45 องศากับแผ่นสไลด์แล้ววางลง ระวังอย่าให้มีฟองอากาศ

            4. นำไปตรวจใต้กล้องจุลทรรศน์ ด้วยกำลังขยาย 10 X 4

                5. ถ่ายภาพเซลล์ที่พบเห็นภายใต้กล้องจุลทรรศน์

            6. ลอกเยื่อหอมแดงโดยใช้เยื่อด้านในกลีบหอม วางบนหยดน้ำบนสไลด์ จากนั้นทำตามข้อ 3 – 5

            7. ลอกเยื่อจากใบว่านกาบหอยโดยเอาด้านท้องใบและทำเช่นเดียวกับข้อง 3 – 5

            8. ให้น้ำจากแหล่งน้ำหยดลงบนสไลด์และปิดด้วยกระจกปิดสไลด์  โดยวางทำมุม  45 องศา กับแผ่นสไลด์ และทำตามข้อ 4 – 5

สิ่งที่ต้องเตรียม

1. หอมแดง

2. ใบว่านกาบหอย

3. สาหร่ายหางกระรอก

4. น้ำก้นบ่อปลา หรือ แหล่งน้ำขัง

ภาระงานที่ต้องบันทึก

1.  ถ่ายรูปตัวอย่างที่ใช้ทำสไลด์สดผ่านกล้องจุลทรรศน์

การใช้กล้องจุลทรรศน์

ใบความรู้ที่ 1

เรื่อง กล้องจุลทรรศน์

ส่วนประกอบของกล้องจุลทรรศน์

1.      Stage  :  วางวัตถุหรือสไลด์ที่ต้องการศึกษา  

2.      Illuminator  :  แหล่งกำเนิดแสงส่องผ่านวัตถุ

3.      Coarse adjustment  :  ปรับระยะภาพ

4.      Eyepiece  :  ขยายภาพที่ได้จากเลนส์ใกล้วัตถุให้มีขนาดใหญ่ขึ้น  

5.      Specimen holder  :  ยึดสไลด์ให้ติดกับที่วางวัตถุ    

6.      Revolving nosepiece  :  ใช้จับเปลี่ยนกำลังขยายของเลนส์ใกล้วัตถุ

7.      Objective lens  :  รับภาพและขยายภาพจากวัตถุที่นำมาศึกษา ส่งผ่านไปยังเลนส์ใกล้ตา   

8.      Fine adjustment  :  ปรับความคมชัดของภาพ  

9.       Arm  :  ยึดระหว่างลำกล้องและฐาน 

10.  Diaphragm  :  ทำหน้าที่ปรับปริมาณแสงให้พอเหมาะ         

การใช้และการเก็บรักษากล้องจุลทรรศน์    

วิธีการใช้กล้องจุลทรรศน์

1.             การถือกล้อง โดยใช้มือหนึ่งจับแขนกล้อง อีกมือหนึ่งรองรับที่ฐาน ต้องยกกล้องในสภาพที่กล้องตั้งตรงเสมอ เพื่อป้องกันส่วนประกอบของกล้องเลื่อนหลุด เช่น เลนส์ใกล้ตา

2.             นำกล้องมาวางไว้บนโต๊ะให้ห่างจากขอบโต๊ะเล็กน้อย

3.             ตั้งลำกล้องให้ตรง โดยที่เลนส์ใกล้วัตถุที่มีกำลังขยายต่ำสุดอยู่ตรงกับแนวลำกล้อง แล้วเปิดไฟ

4.             นำสไลด์ที่เตรียมไว้วางบนแท่นวางวัตถุ ให้วัตถุอยู่ตรงบริเวณที่แสงผ่าน

5.             ปรับเลนส์ตาทั้งสองให้ระยะห่างพอดีกับช่วงตาของผู้ศึกษา แล้วเริ่มปรับหาระยะภาพที่กำลังขยายต่ำสุดโดยใช้ปุ่มปรับภาพหยาบ ถ้าแสงสว่างเกินไปให้ลดความสว่างโดยใช้ไดอะแฟรม

6.             เมื่อเจอภาพแล้วต้องการปรับความคมชัด ก็ให้ใช้ปุ่มปรับภาพละเอียด

7.             เมื่อต้องการขยายภาพให้ใหญ่ขึ้น ควรหมุนเปลี่ยนกำลังขยายเลนส์ใกล้วัตถุโดยใช้จานหมุน จากนั้นให้ปรับความคมชัดภาพด้วยปุ่มปรับภาพละเอียด

ข้อควรระวัง

1.             ระวังอย่าให้เลนส์ใกล้วัตถุสัมผัสกับกระจกปิดสไลด์

2.             เมื่อปรับกำลังขยายของเลนส์ใกล้วัตถุสูงกว่า x10 แล้วต้องการปรับความคมชัดของภาพ ให้ใช้เฉพาะปุ่มปรับภาพละเอียดเท่านั้น

3.             ห้ามใช้เลนส์ใกล้วัตถุกำลังขยาย x100 หากไม่ได้หยดน้ำมันลงบนสไลด์ และขาดความชำนาญ

วิธีเก็บกล้องจุลทรรศน์

1.             หลังจากใช้กล้องจุลทรรศน์เสร็จแล้วตรวจดูความเรียบร้อยของส่วนต่างๆเสียก่อน

2.             ใช้ผ้านุ่มทำความสะอาดกล้องเฉพาะส่วนที่เป็นโลหะ และใช้กระดาษเช็คเลนส์ทำความสะอาด

3.             หมุนเลนส์ใกล้วัตถุที่มีกำลังขยายต่ำสุดให้อยู่ตรงกับตัวกล้อง แล้วเลื่อนแท่นวางวัตถุลงมาต่ำสุด

คำถาม

1.             เลนส์ที่ใช้ในกล้องจุลทรรศน์มีกี่ชนิด อะไรบ้าง

2.             ไดอะแฟรมทำหน้าที่อะไร

3.             จงบอกความแตกต่างของปุ่มปรับภาพหยาบและปุ่มปรับภาพละเอียด

งานที่ต้องบันทึก

1.             ถ่ายรูปกล้องจุลทรรศน์พร้อมชี้ส่วนประกอบ

2.             วาดภาพอักษร “ ง ”  ที่มองเห็นผ่านกล้องจุลทรรศน์ที่กำลังขยายของเลนส์ใกล้วัตถุเท่ากับ x10 พร้อมบอกลักษณะภาพ

3.             ภาพถ่ายวัตถุที่มองเห็นจากกล้องจุลทรรศน์ พร้อมบอกกำลังขยาย

4.             ตอบคำถามด้านบนลงในรายงานผลการทดลอง